Objetivo
En esta práctica realizaremos la
extracción del ADN de las células de pulpa de
plátano poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el
extraordinario grado de arrollamiento, que permite el
empaquetamiento en el núcleo celular de larguísimas
cadenas de esta molécula.
Tras la extracción se realizará una
tinción específica del ADN obtenido.
Material necesario
| - Un plátano |
- Batidora de mano |
- Matraz |
| - Filtro tipo cafetera |
- Embudo para filtrar |
- Alcohol 96º muy frío |
| - Pipeta Pasteur |
- Tubo de ensayo |
- Gradilla |
| - Vaso para batir |
- Agua destilada |
- Espátula |
| - Vaso de precipitados |
- Detergente tipo lavavajillas |
- Un poco de sal común |
Fundamento
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El ADN se encuentra en el interior del núcleo
de todas las células, disperso y muy replegado, unido a
proteínas para formar la cromatina. Por lo tanto, podremos
extraerlo a partir de prácticamente cualquier material de
origen biológico. Para ello es necesario homogeneizar el
tejido disgregándolo y separando sus células y
demás componentes, luego romper las células para
separar el núcleo y romper éste para liberar el
ADN, separarlo de las proteínas y precipitarlo para
separarlo de la solución acuosa.
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El ADN (y también algo de ARN)
aparecerá entonces como un agregado de fibras blanquecinas
de aspecto mucoso que se adhieren a una varilla de vidrio o a la
pipeta. Podemos añadir unas gotas de azul de metileno o
verde de metilo al tubo para teñirlo. Por último,
se puede situar sobre un porta, teñirlo de la misma manera
y observarlo al microscopio. También se puede conservar
dejándolo secar sobre papel de filtro o suspendido en
alcohol al 50% o 70%.
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Procedimiento
- Batir un plátano en 250 ml de agua destilada
(o mineral en su defecto, pero no del grifo) durante 15 a 20
segundos hasta obtener una papilla homogénea.
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- Por otra parte, en un vaso de precitados
pequeño se mezcla una cucharada de champú o
lavavajillas líquido con dos pizcas de sal de mesa.
- Añadir 20 ml de agua destilada a la mezcla
de champú y sal.
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- Añadir ahora tres cucharaditas del
puré de plátano a lo anterior y mezclar con la
espátula durante 5 ó 10 minutos evitando formar
espuma.
Durante este tiempo se pueden preparar los tubos
de ensayo como se describe en el siguiente punto y discutir la
acción que desempeñan el detergente y la
sal.
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- Preparar un tubo de ensayo con alcohol
etílico por cada grupo y poner a enfriar lo máximo
que sea posible, por ejemplo en baño de agua con hielo.
Mejor aún si se ha mantenido refrigerado hasta el momento
de realizar la práctica.
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- Con los pasos anteriores hemos conseguido liberar
el ADN en la disolución acuosa, la cual contendrá
también diversos restos tisulares y celulares. Para
eliminar esos restos dejamos filtrar la solución durante
varios minutos en papel de filtro, filtro de cafetera o un
paño de algodón suave, hasta obtener unos 5 ml de
filtrado.
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- Para precipitar el ADN separándolo de la
disolución, se toma una parte del filtrado con una pipeta
Pasteur y se añade suavemente al tubo de ensayo que
contiene el alcohol muy frío. El filtrado, más
denso que el alcohol y algo turbio, se deposita en el fondo del
tubo. Dejar reposar durante 2 ó 3 minutos sin moverlo en
absoluto.
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- Veremos precipitar ADN de color blanco en la
interfase con el alcohol y ascender lentamente formando un grumo
de aspecto algodonoso.
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- Podemos teñirlo añadiendo unas gotas
de azul de metileno o verde de metilo al tubo.
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- Se puede extraer ADN del tubo recogiéndolo
cuidadosamente con una varilla de vidrio o un instrumento similar
que se hace girar lentamente.
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- Ahora se pone un poco de ese ADN sobre un
portaobjetos y se tiñe con azul de metileno durante 3
minutos. Se limpia el porta y se lleva al microscopio para su
observación.
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- Otra posibilidad es conservar el ADN obtenido por
uno de los siguientes métodos:
- en un frasco bien cerrado con alcohol etílico al 50% o
70%.
- dejándolo secar al aire extendido sobre papel de
filtro.
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